Nel ventennio 1838-1858 la consistenza patrimoniale della Biblioteca aumentò sensibilmente: dalle 50.000 unità, che costituivano la dotazione libraria al momento del trasferimento in Archiginnasio, si passò a più di 84.000.
Dal 1° agosto 1868 la Biblioteca fu nuovamente chiusa per i lavori di riscontro dei fondi librari pervenuti in séguito alle seconde soppressioni degli ordini religiosi, per effetto delle leggi postunitarie (luglio 1866).
Si trattava di una mole di 63.512 fra volumi e opuscoli provenienti da 11 librerie diverse: quelle dei barnabiti di Santa Lucia (18.000 pezzi), dei Francescani (quasi 16.000 volumi), dei frati dell'Annunziata, dei frati dell'Osservanza, dei Domenicani, degli Oratoriani, dei Cappuccini, dei Padri dello Spirito Santo, degli Agostiniani, dei Canonici di San Salvatore e dei Serviti.
La chiusura al pubblico della Biblioteca venne quindi prolungata a tutto il 1869.
Durante questo secondo lungo periodo di chiusura al pubblico venne definita la collocazione, con suddivisione su base classificata, del materiale librario, l'aggiornamento dell'indice generale, e l'impostazione di una politica delle acquisizioni molto attenta a documentare la "storia patria".